Takie kompozycje nazywane są, w nieco staromodnej polszczyźnie, św. Anną Samotrzecią. Samotrzeć to przebywanie w odosobnionym miejscu z dwiema innymi osobami. Obrazy te oznaczały zwykle zasugerowanie niepokalanego poczęcia Matki Bożej, tego, że również Ona narodziła się bez grzechu pierworodnego. W czasach Leonarda istniała już wiara w niepokalane poczęcie Maryi, dogmatem stało się to jednak dopiero w XIX wieku.

Obraz Leonarda ma jednak jeszcze dodatkowe znaczenia. Widzimy, że mały Jezus bawi się z barankiem. To oczywiście symbol Jego ofiarnej śmierci na krzyżu. Maryja zachowuje się tak, jakby zrozumiała symboliczne znaczenie tej zabaw, i powstrzymuje swojego syna, próbując odciągnąć Go od baranka. Miłość macierzyńska każe Jej bowiem za wszelką cenę chronić swoje dziecko.

Inaczej zachowuje się natomiast św. Anna, przyglądająca się tej zabawie wnuka z dobrotliwym uśmiechem. Jej postać pełni bowiem tutaj funkcję symboliczną. W dawnych wiekach artyści często przedstawiali Kościół Chrystusa jako kobietę (słowo „Kościół” w języku łacińskim i językach romańskich jest rodzaju żeńskiego) – Ecclesię. Anna – Ecclesia – doskonale rozumie konieczność zbawczej ofiary Chrystusa.

Obraz stał się słynny przed stu laty również dlatego, że próbował go zinterpretować twórca psychoanalizy Zygmunt Freud. Dostrzegł on, że niebieski płaszcz Maryi układa się w kształt przypominający sępa (dziób miałby się znajdować z lewej strony) – ptaka, którego obsesyjnie miał bać się Leonardo. Wysnuł więc teorię opartą na symbolicznym znaczeniu sępa. Teoria jednak runęła, kiedy się okazało, że Freud oparł się na błędnym tłumaczeniu zapisków Leonarda. W rzeczywistości artysta obawiał się nie sępów, ale jastrzębi.